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天然生物活性物質研究

【 更新時間:2012/6/29 18:41:00 JY3098
第一章  天然生物活性物質研究
 
第一節  天然藥物的簡況
一、天然藥物
        天然藥物是從植物、動物和微生物等天然資源中開發出來的藥物,是藥物的一個重要組成部分,包括中藥、草藥、民族藥物及民間藥、地方習慣用藥等,主要是指來源於動植物及其他生物、具有明確治療作用的單一組成或多組分藥物,如來源於植物、微生物、海洋生物、內源性生物活性的物質。我國的天然藥物資源豐富,需求廣泛,有著很好的發展基礎,趨勢良好。據全國大規模中藥資源普查表明,我國中藥資源已達12772種,其中藥用植物占11118種,藥用動物占1547種。
 
二、天然藥物的優勢
      幾十年來,我國對天然藥物進行了大量研究。許多天然來源的化合物已被發現具有獨特的生理活性,在此基礎上一大批具有特殊治療作用的藥物被開發出來。天然活性物質往往具有結構新穎、活性高、副作用少等優勢,是製藥工業中新藥研發的重要資源,也是我國研製具有自主知識產權藥物的主要源泉。
在國內外新藥研究的曆史上,天然創新藥物的研究往往成為藥物研究領域新的突破口。例如,紫杉醇的研究導致作用於微管的抗癌新靶點的發現;辣椒堿的研究導致鎮痛新靶點辣椒堿受體的發現。建國以來,我國在創新藥物研究方麵取得的有影響的重要成果主要來自於天然藥物的研究,如我國首創的抗瘧天然藥物青蒿素及其衍生物在國際上產生了巨大的影響;新型抗早老性癡呆藥物石杉堿甲,成為該研究領域國際關注和追蹤研究的一個熱點。
鑒於天然藥物多重的優勢特點,加強天然藥物研究,對我國社會和經濟的發展、尤其是人口與健康事業和醫藥產業的發展,具有重要和緊迫的意義。
 
三、我國天然藥物的現狀
我國的天然藥物資源可以劃分為九個中藥區:東北區、華北區、華東區、西南區、華南區、內蒙古區、西北區、青藏區以及海洋區等九個中藥區。每個藥物區都有著豐富的天然藥物資源。九大藥區以西南區蘊藏的天然藥物資源最多,為我國中藥材的主要產地,全區天然藥物資源約5 000種,其中植物類約4 500多種,動物類300多種,礦物類約80種,例如川芎、川附子、川牛膝、黃柏、川黃連、川貝母、川大黃、獨活;三七、雲當歸;天麻、杜仲、半夏、吳茱萸等。其次是華南區和華東區,華南區擁有近4 000種的天然藥物資源,其中植物類3 500種,動物類200多種,礦物藥30種左右,如著名的廣藿香、巴戟天、鉤藤、檳榔、肉桂、降香、胡椒等;華東區擁有3 000種,其中植物類2 500餘種,動物類300餘種,礦物類約50種,有著名的道地藥材浙八味,浙貝母,麥冬、玄參、白術,白芍、杭菊花、延胡索等。另外,東北區還有天然藥物資源2 000餘種,如人參、熊膽、鹿茸、五味子、黃柏、刺五加等。華北區有1 800餘種,植物類如酸棗仁、北蒼術、遠誌、北柴胡、黃芥知母、連翹、葛根、柏子仁;礦物類如龍骨、赫石、磁石、爐甘石及陽起石等。此外,在青藏區還蘊藏著量占全國60%~80%以上的天然藥物資源如冬蟲夏草、甘鬆、大黃等。在海洋區也有近700種天然藥物資源。
天然藥物一直以來都是人們生活中不可缺少的一部分。隨著近年來我國天然藥物有效成份提取、分離、純化及結構研究技術的不斷發展和應用,天然藥物作為來自植物的“綠色藥品”,已受到越來越多消費者的青睞,使天然藥物開發利用走向國際化。一些天然藥物優勢企業加速形成,並朝著跨行業、跨地區的大集團方向發展,對我國中成藥工業產業結構優化調整將起到促進作用。而隨著天然藥物市場的迅速發展,我國中藥業能根據不同地區、人群、層次的需求向市場提供所需要的各種藥品。目前我國藥品(包括中西成藥) 消費總額在2 300億元左右,人均用藥農村約為59元,城市約為88,其中,老年人的藥品消費占藥品消費總額的50%以上,隨著我國人口老齡化的加劇,今後的藥品消費總額還將不斷增加,天然藥物的市場需求不可小視。
 
第二節 天然藥物與知識產權保護
一、天然藥物知識產權保護存在問題
知識產權製度是人類社會文明和進步的產物,是為了保護智力成果和推動社會科技與經濟發展的客觀需要而誕生的法律製度。由於它具有廣泛的交換性和明顯的財產屬性,15 世紀後各國政府開始逐步意識到這類產物的社會價值和經濟價值,開始通過頒布法令、法律,建立起各種保護性、鼓勵性製度,以確認智力創造者對其所創造的精神產物享有的權利,並逐步形成了知識產權法律製度體係[1]。知識產權製度是保持傳統醫學特色優勢,發揮其在人類衛生保健中作用的一個重要保障。目前我國對天然藥物,尤其是中醫藥知識產權尚不能實施全麵有效的保護,遠遠不能適應中醫藥發展的需要。因此,開展中醫藥知識產權保護研究,是基於時代的要求、現實的緊迫性和中醫藥共同發展的需求。
但是我國的中醫藥知識產權保護尚處於初級階段,盡管開展了眾多工作並已取得一定的成績,但是客觀來說在中醫藥知識產權保護方麵仍存在很多問題。
1 中藥自身特點不利於進行專利申請和侵權認定
中藥知識產權保護的漏洞使國外許多製藥公司有機可乘,肆無忌憚仿製我國中藥。如果以侵權告之,理由非常不充分。因為中藥大都是複方,幾十種物質混合在一起,加工處理時這些物質又可能發生複雜的化學反應,所以在製成中成藥後。即使采用最先進的儀器也無法分析出它的原始配方和生產工藝。因此在實踐中,很難證明他人是否侵權,自然就沒有辦法保護自己的權利。
2 中醫藥知識產權保護意識淡薄
目前,我國對中醫藥知識產權保護的意識比較淡薄,中醫藥知識產權絕大部分尚未進入保護狀態這是造成資源流失、生物盜版的最主要原因。相當部分的中醫藥機構及人員知識產權保護意識薄弱,對知識產權的重要性認識不足,對其潛在效益缺乏了解,造成知識產權流失[2]。這種狀況極大地影響了我國中醫藥文化的原創性及專利成果的轉化和利益獲取。另外,由於曆史或人為的原因,許多少數民族的中醫藥知識流散於民間,未能進行及時的收集整理,流失嚴重。在專利申請領域,我國中醫藥的職務發明申請比例過小,反映我國醫藥企業和科研單位知識產權保護意識仍然比較淡薄,還沒有充分運用專利這一有力武器來保護自己的知識產權。
3 中醫藥知識產權保護製度有待完善
現有的專利保護製度不能完全適應中醫藥知識產權保護的要求,在一定程度上影響了中醫藥的發展。我國實施專利製度較晚,現行專利製度借鑒和沿襲了西方的專利製度,在藥品的專利保護上也就基本是參照國外西藥的保護模式,因此不能滿足完整保護中醫藥知識產權的需要。專利費用高,回報周期長且比較隱形,致使許多企業不願意多投入,申請專利積極性不高,自動撤銷保護申請的案例增多[2]。傳統醫學書籍、藥物技術等由於曆史或技術原因無法采用版權或專利的方式加以保護,大量的中醫藥資源正被他人無償開發利用,因此加強中醫藥知識產權的保護已勢在必行。
4 政策法規保護具有相對的局限性
中藥品種保護是行政保護的主要手段,但其所保護的僅僅是中藥品種,對中藥技術開發前期研究活動中的技術秘密包括處方組成和工藝製法是無法加以保護的。首先,《中藥品種保護條例》是行政法規,在法律體係中地位過低;中藥品種保護屬於行政保護,采用的是行政救濟手段,當發生了侵權現象時,權利人隻能請求相關主管部門調處,對於主管部門的調處結果,當事人隻能提起行政複議、行政訴訟,缺乏必要的司法保護。其次,較之專利保護,中藥品種保護屬弱保護。由於中藥品種保護尚未與國際接軌,隻在中國大陸範圍內有效,不具有域外效力。這不利於中醫藥產業的國際化發展,不利於國外先進技術的引進,在中藥產品走向國際市場的同時,有可能受到國外競爭者的侵害[3]
5 專業組織機構與管理人員相對缺乏
民族醫藥知識產權保護和管理的專業人才缺乏,運用知識產權手段的能力還不高,傳統知識的保護仍然缺乏有效的措施[4]。在我國,中醫藥是中國特有的傳統知識,需要專業人員來組織、管理和研究。與發達國家比較來看,我國在對知識產權管理人員的培訓、製定相關的管理製度和有關機構的建設等方麵還存在相當大的差距。所以加緊培養一部分通曉我國中醫藥知識產權保護規定,並且熟悉國內外專利及藥品注冊法規和國際知識產權保護規則的專門人才,將有利於我國中醫藥的開發、宣傳、專利申請等工作的開展。缺乏相關的中醫藥知識產權保護組織與機構,這使知識產權保護的研究始終處於民間散發的狀態,難以形成更廣的共識和對國家有關政策的製訂發揮更大的參考作用,也缺乏為中醫藥企業提供知識產權保護的有力參考。不解決這些問題,中醫藥產品在進入國內國際市場的同時就難以保護自身權益,也將導致中醫藥生產程序的混亂與無序[5]
二、天然藥物知識產權保護途徑
1 中醫藥知識產權保護法律法規及其配套措施的確立
近年來,我國已經先後出台了許多知識產權法律及配套法規,如《中華人民共和國專利法》、《中華人民共和國商標法》、《中華人民共和國藥品管理法》等,不僅擴大了中醫藥的知識產權保護範圍,而且通過行政、司法等途徑加速了中醫藥知識產權法製化、規範化的管理進程。
1.1 專利保護
我國自1985 年4 月1 日起施行專利法,1992 年第一次修訂了《專利法》,開始對藥品給予專利保護。1992 年10 月14 日,國務院頒布了《中藥品種保護條例》。該條例保護在中國境內生產的、已經列入國家藥品標準的品種,包括中成藥、天然藥物的提取物及其製劑和中藥人工製成品。作為《專利法》的補充和完善,《中藥品種保護條例》是法規層次的,由取得中藥品種保護資格的企業生產,不具有獨占性。
1.2 著作權保護
1991 年6 月1 日,我國《著作權法》及其實施條例正式施行,並在2001 年進行了修改。該法明確了對民族醫藥典籍、中醫圖書、中醫處方、中醫學術論文、中醫信息資料等版權的保護,並通過打擊盜版和侵權行為,有力地維護了著作權人和讀者的權益。以往相當部分的中醫藥文獻由於年代久遠,缺乏係統的整理保護,大量珍貴的醫藥知識進入公知領域,無法受到著作權的保護。現今對中醫藥古籍、文獻重新進行匯編和整理,可以重新得到著作權的保護。
1.3 商標保護
商標,是用以區別一種產品或服務與另一種商品或服務的標記。藥品商標作為醫藥企業的知識產權,與其他動產和不動產一樣都是企業的財富,而且這種無形財產不可用有形的價值衡量。因其有助於區別藥品的不同生產者、經營者,提高藥品的服務和質量,有助於藥品的廣告宣傳,有時甚至比有形財產更寶貴。1983 年3 月施行的《商標法》,明確了關於藥品商標注冊的規定。經1993 年和2001 年2 次修改,根據我國現行商標法實施細則第6 條的規定,人用藥品必須使用注冊商標。這樣中成藥與其他藥品均被納入了強製進行商標注冊的軌道,商標管理由此成為藥品管理的一個有機組成分[6]。近20 多年來,我國一大批中藥商標得到了保護,這既是對傳統中藥本身的保護,又是對中醫治療效果的肯定[7]。截至2005 年我國的馳名商標673 件,其中中藥馳名商標有同仁堂、雲南白藥、太極、三金、九芝堂、麗珠、三九、神威、健民、養生堂等22 件[6]。同時,一些不能獲得專利保護的民族藥產品,也可以通過注冊商標來保護其產品。例如,商標權對於蒙藥知識產權的保護有著重要意義。蒙藥作為特殊商品,消費者無法靠自己的能力辨別質量的優劣,同一產品最有效的區別方式就在於使用不同的商標。
1.4 地理標誌的運用
在我國,地理標誌既可以作為商標使用而得到商標的保護,獲得商標的專有權,又可以作為原地域產品專用標誌得到保護。中藥學的道地藥材特點恰恰與地理標誌的含義不謀而合。我國許多民族地區由於環境、氣候、溫度、陽光等自然條件,有許多在國內外有享有聲譽的道地藥材,如雲南的三七、寧夏枸杞、長白山人參等,這樣藥材質量最佳,人們更願意選擇使用,因此原產地標誌有重要經濟意義。在國外,如韓國,將其對外出口的人參注冊“高麗參”商標,列為國家專賣,這即有利於提高本國藥材的知名度和競爭力,又可以對本國藥材進行有效保護與控製。內蒙古自治區蒙藥資源豐富,素有“天然藥物之鄉”之稱,在國內外享有很高的聲譽。我國作為藥材出口大國,更應當采取類似的措施[12]。因此,在道地中藥材的知識產權保護中引入原產地標記、地理標誌和證明商標(或集體商標)的保護,將對中藥材的貿易起到規範和引導的積極作用,極大地增強我國中藥材在國際貿易的地位和競爭力。據不完全統計,目前已申請了原產地保護的道地中藥材有浙江省慈溪楊梅和餘姚楊梅、河南省西峽山茱萸、雲南省文山三七、河南省焦作市“四大懷藥”、四川省安嶽檸檬、雲南省昭通天麻、山東省東阿阿膠等。從1995 年至2005 年5 月底,國家商標局共核準注冊地理標誌證明商標或者集體商標110 件[7]
1.5 政策法規保護
國務院於1992 年通過和發布了《藥品行政保護條例》和《中藥品種保護條例》,作為對知識產權立法的補充,分別具體規定了中藥的行政保護期限,是對中藥知識產權保護的重要補充[8, 9]。2001 年製定的《中華人民共和國藥品管理法》明確將中醫藥納入管理範圍。該法第3 條規定“國家發展現代藥和傳統藥,充分發揮其在預防、醫療和保健中的作用。國家保護野生藥材資源,鼓勵培育中藥材”。實踐證明,以上法律及法規的實施,都在一定程度上對我國的藥品開發和市場管理起到了積極的作用。2006 年4 月,國務院發布了《中華人民共和國中醫藥條例》,這是我國第一部中醫藥行政法規。該《條例》對保護重大中醫藥科研成果,避免資源流失做出了明確規定,中醫藥等被納入了我國專利法保護的範圍,中醫藥的產品、方法、用途可以得到專利保[6, 10]。以上這些行政保護措施是中藥知識產權保護的重要補充,不僅有利於引進國外的新藥專利技術,更重要的是可以促進和保護我國藥物的自主研製與開發,有利於我國醫藥科技事業的發展。
1.6 商業秘密保護
《反不正當競爭法》把商業秘密定義為:不為公眾所知、能為權利人帶來經濟利益、具有實用性並經權利人采取保密措施的技術信息和經濟信息。民族藥配方複雜多樣、工藝複雜,單從單品分析很難應用反向工程倒推出其配方和工藝,因此商業秘密將是民族藥知識產權保護很有效的一種方式[11]。我國許多知名的商標都是用商業秘密保護,如雲南白藥,特別是在現在專利製度對我國民族醫藥保護不利條件下,商業秘密保護尤為重要。
(1)醫藥配方。
由於地域性和民族性等自身特征,民族醫藥的大部分寶貴成果以祖傳秘方的形式在一個家族或僅在一個家族醫藥企業內部流傳,有的已經喪失新穎性,不能獲得專利保護,但民族醫藥也存在大量所有者不願意申請專利的祖傳秘方。這些方劑對民族醫藥企業的生存發展具有重大意義。“保住秘密就保護了市場”,可口可樂公司的神秘配方全世界隻有四人知道,一直作為最高機密加以保守至今,可口可樂公司仍牢牢掌握世界飲料市場的半壁江山。同樣要想使民族醫藥在世界上占據優勢地位,采取保密措施也至關重要。
(2)醫藥炮製技術。
我國民族藥特殊品種處方保密政策實行了許多年,對民族藥秘方和炮製的保護切實起到了積極作用。但是最近有關部門似乎要求所有傳統藥方配劑公開,理由是患者和處方醫生有權對藥物成分加以了解。實際上,由於醫藥方劑的特殊性,不是一般患者和醫生所必須了解的。並且如果把炮製及方劑秘密公開,正中某些窺視者下懷,將對民族醫藥研究和生產造成極大的打擊。同時,在保密品種中,有些藥物適宜公開,有些不適宜公開。對於公開什麽、不公開什麽,應由業內專家作出,而不是按照西醫藥的結構成分理論將之公開化。
2 民族醫藥知識保護的特殊途徑
2.1建立民族醫藥知識數據庫
傳統知識保護中最嚴峻的問題是如何防止生物盜版行為。作為我國傳統知識重要組成部分的民族醫藥知識,也麵臨這一問題。所謂“生物盜版”,即個人或者機構對農業和本地社區的知識和遺傳資源的占有,以尋求對這些資源和知識的排他性壟斷控製,通常通過專利或植物育種者權利的方式。[13]生物盜版行為在我國已日漸突出:日本在中國六神丸的基礎上開發出救心丸,年銷售額高達上億美元;韓國在我國牛黃清心丸的基礎上開發出了牛黃清心液,年產值達0.7億美元。為了防止類似事件在民族醫藥領域再次發生,應為已經進入公共領域的民族醫藥知識進行收集歸檔,進而建立一個麵向世界開放的民族醫藥知識數據庫,保護這些知識的在先權利,防止民族醫藥知識生物盜版行為的發生。印度開展了名為數字圖書館的實驗工作。這項工作為有關藥用和其他用途植物(已經進入公共領域的)的傳統知識進行收集歸檔,以為建立一個便利的計算機數據庫作出準備。這類數據庫將使得全世界的專利管理部門都能夠查找和審查,以便確定被申請專利是否已經普遍應用過或是否存在在先權利,從而避免為一些專利頒發證書,也可以避免生物盜版。如2008年8月,我國首個“蒙藥方劑數據庫”經過有關專家曆時兩年的努力,在內蒙古醫學院蒙藥學院建成。這個數據庫是目前收錄文獻最全、方劑最多的蒙醫藥數據庫,課題成果的共享性、開放性、通用性、網絡化及蒙、漢兩種文字操作界麵等都屬於在蒙醫藥領域和少數民族文字信息技術領域中的創新之舉。“蒙藥方劑數據庫”於2005年由內蒙古自治區衛生廳批準立項,2007年經過項目驗收,2008你那8月基本完成第二期數據錄入工作。這個數據庫是現代信息技術與民族醫藥傳統研究手段的結合,對於提高蒙醫藥學科學技術水平,推動蒙醫藥學的現代化與信息化,促進蒙醫藥學產業化發展、走向世界將發揮重要的作用。“蒙藥方劑數據庫”第一期工程共錄入《蒙醫藥方劑學》、《四部醫典》、《蒙醫藥方匯編》等文獻10部,登錄方劑達到4814個。二期工程共錄《內蒙古蒙成藥標準》、《四部醫典藍琉璃》等10部文獻,目前,登錄方劑達到5000個。蒙藥方劑數據管理係統,作為醫療行政機構、蒙醫藥教學與醫療機構的整個信息化管理係統的重要組成部分,這對於民族醫藥其他分支領域的信息化具有很強的借鑒和指導作用。
2.2  民族醫藥專門立法
法律是保護合法權利的最有力手段,所以應該建立民族醫藥知識的法律保護體係使民族醫藥知識的保護有法可依。雖然民族醫藥知識的保護可以從《憲法》和《民族區域自治法》中尋找法律依據,但是這些法律的規定過於籠統,很難在實踐中有效運用。而其他法律,如《職業醫師法》、《中華人民共和國中醫藥條例》、《藥品管理法》、《國家保密法》、《科技進步法》中規定的內容又過於分散,也不能針對民族醫藥知識進行有效保護。所以我國政府有關部門應該根據各民族醫藥知識的特點,製定出台相關的法律規範,為民族醫藥知識的保護提供法律依據。在製定相關法律時,要注意借鑒國際上有關國家在保護傳統醫藥知識方麵取得的成功經驗,如泰國將傳統醫藥分為國家配方、私人配方、一般配方予以區別保護,較好地兼顧了個人、國家及公眾之間的利益,值得我們借鑒。
 
第三節 天然藥物有效成分的研究
一、天然藥物有效成分研究概況
天然藥物尤其是中藥和民族藥物,是我國人民數千年來與疾病鬥爭的結晶,是中華民族文化遺產的重要組成部分。我國地域遼闊,地理和氣候帶類型豐富多樣,藥用植物資源十分豐富,對保障人民身體健康和推動世界藥學的發展都做出巨大貢獻。隨著天然藥物日趨國際化,天然藥物的活性成分研究越來越受到人們的重視,已經成為當今藥物研發的熱點。特別是在新藥及其新藥先導化合物發現中起著不可替代的作用。下麵根據天然藥物有效成分的主要藥理活性來簡要介紹天然藥物有效成分研究概況。
抗腫瘤藥用植物有效成分研究概況
1.1生物堿類
生物堿類成分在已分離出的具有抗癌作用的活性成分中占較大比重,研究較多的為吲哚類生物堿和喹啉類生物堿。生物堿類抗腫瘤成分主要對卵巢癌、淋巴癌和消化道係統癌如肝癌、結腸癌等有較顯著的療效。目前研究的生物堿類抗腫瘤機製一般可分為2類,一類是直接殺傷腫瘤細胞;另一類是幹擾細胞周期的有絲分裂階段,抑製腫瘤細胞的分裂和增殖。此外,生物堿類抗腫瘤成分在誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡以及提高機體免疫力方麵亦表現出一定的作用[14]
Dallavalle等[15] 通過構效關係研究發現A、B、C 和D環的共平麵結構是喜樹堿類化合物抗腫瘤活性必需結構,C-7、9, C-9、10, C-10、11 間增加一個環活性增加,C-7、9位引入基團可增加活性;在C- 5、12、14位取代則活性降低或喪失,D環吡啶酮為必須的抗腫瘤藥效基團,C20的S構型被認為是活性所必需的,20(S)異構體較20(R)異構體活性強。
1.2 芪類化合物
芪類化合物的結構特點是由2個聯苄母核構成,包括菲類、聯苄類及其他的9,10-二氧菲衍生物。主要結構是多羥基芪類化合物(PHS)又稱芪多酚,是具有均二苯乙烯母核的酚羥基衍生物或其聚合物的類物質的總稱,在植物的木質部的薄壁細胞中含量最多,是植物受到病蟲害等不利刺激時產生的應激產物[16]。多羥基芪類化合物抗腫瘤機製主要有以下幾個方麵:①幹擾真核細胞微管的功能,導致細胞功能障礙,達到抗腫瘤的效果;②抑製酪氨酸蛋白激酶或蛋白激酶C活性,通過對細胞膜轉位的阻斷或改變腫瘤細胞中的信息傳遞,抑製腫瘤細胞的生長;③抑製環氧合酶(COX-1)活性,從而阻止環氧合酶刺激腫瘤細胞生長、抑製免疫係統和活化損害基因的致癌物質;④抗氧化作用,能夠抑製自由基的生成從而發揮預防腫瘤的作用[17]。此類抗癌物質的代表物為秘魯產豆科植物五角決明根的甲醇提取物中分離得到的活性成分白藜蘆醇(Res),主要存在於虎杖、葡萄、花生、毛穗藜蘆、毛脈酸模等植物中,對腫瘤細胞的起始、促進和發展3個階段均有抑製作用,能有效的抑製自由基產生的氧化損傷;預防細胞惡變,通過激活P53,蛋白誘導腫瘤細胞凋亡,幹預細胞周期並抑製增殖[18]
1.3 黃酮
黃酮類化合物具有顯著抗癌、抗氧化作用受到廣泛關注,其抗腫瘤作用主要表現在抗細胞增殖、誘導細胞凋亡和增強抑癌基因活性及抑製癌基因表達等方麵。根據構校關係研究,黃酮類化合物分子中心的α, β盧不飽和吡喃酮是其具有各種生物活性的關鍵,C7位羥基糖苷化和C2, C3位雙鍵氫化則會引起黃酮類化合物的生物活性降低,而A, B, C三環的各種取代基則決定了其特定的藥理活性。黃酮類化合物抗腫瘤作用可能受兩種結構因素影響,一方麵與其苯環上的取代基有關,A環上糖的類型起重要作用,如葡萄糖連接在A環上就有活性,但如果鼠李糖或蘆丁糖連在該位置上就無活性;另一方麵羥基的位置也會對其抗腫瘤活性產生影響,B環上3’, 4’和5’連有羥基的黃酮類化合物抗腫瘤活性比其他類型連接活性強[19]
2 HIV海洋天然活性成分研究概況
自1983年首次分離到HIV, 迄今為止仍無一種療效理想的化學藥物問世。現僅有11種藥物得到批準用於治療,雖然這些藥物不乏有比較好的抗艾滋病病毒的效果,能增加治療艾滋病的機會。但是,與其它病毒性疾病相似,在艾滋病的藥物治療過程中,也存在著一個病毒的變異和耐藥性問題,同時西藥開發的成本極為昂貴,毒性又常常太大。由於中藥具有複方、低毒、有效、可長期服用等特點,近年國內外許多研究者轉向了中藥和天然植物,並對其有效成分和作用機製進行了大量的研究。
2.1 藍藻門
日本學者Hayashi K等[20]從螺旋藻屬植物鈍頂螺旋藻中分離出一種硫酸化多糖, 命名為Ca-sp。係由鼠李糖、核糖、甘露糖、果糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、硫酸和鈣組成,它能選擇性地抑製包膜病毒穿人宿主細胞,具有抑製HIV 和單純疤疹病毒的作用,與葡聚糖硫酸酯(DS) 相比,Ca-sp 具有更強的抑製HIV 病毒的活性。研究表明,鈍頂螺旋藻具有一定的富集和有機化硒的功能,從而可增強免疫功能,阻止HIV病毒感染,並可延緩HIV感染發展為AIDS 的進程[21]
2.2 綠藻門
另一位日本學者Lee 和Hayashi K[22]從藻類的寬礁膜屬植物中得到一種天然的硫酸化多糖鼠李糖硫酸酯(RS)。體外實驗表明,具有較強的抑製HIV病毒的活性。根據時間增加實驗結果表明,RS抗病毒作用於病毒的複製階段而不是吸附期。同時RS與疊氮胸苷合用於抗HIV 病毒時有增效作用。Amornrut等[23]從紫斑文蛤中分離出一種新的多糖,由半乳糖的硫酸酯組成。該多糖具有抑製HIV誘導的合胞體形成的作用。
2.3 其他
此外,具有抗HIV 的活性成分還有從日本五針鬆中分離獲得的鬆塔多糖、紫花地丁多糖、盾葉鬼臼中的盾葉鬼臼醇、異株蕁麻中的蕁麻凝血素、杜仲中的綠原酸、天仙果中的天仙果多糖、虎杖的水提物、大黃的乙醇提取液、美洲商陸中的美洲商陸抗病毒蛋白、大豆中的大豆皂苷、黃花龍芽中的種子提取物環狀三萜、華東水楊梅中的三菇類成分、喜樹中的喜樹堿、大葉木鱉子中的大葉木鱉子根蛋白、絲瓜中的絲瓜子蛋白、油瓜中的油瓜根蛋白、山地香茶菜中的山地香茶菜提取物H-1,H-9、夏枯草中的夏枯草多糖、穿心蓮中的脫氫穿心蓮內酯丁二酸酯、菊花中的金合歡素-7-O-β-D-毗喃半乳糖昔、大蒜中的大蒜GO889、蘆薈中的蘆薈膠、水仙屬植物中的凝血素、魔芋中的葡甘露低聚糖、薑黃中的薑黃素等。
3 中藥護肝降酶有效成分的研究概況
慢性病毒性乙型肝炎是嚴重危害中國人民身體健康的一種常見病、多發病,特別是垂直感染或圍產期感染者更是遷延難愈,大約25%患者最終發展為肝硬化和肝癌。抗肝損傷、抗病毒、調整免疫力是治療乙型肝炎三大措施,在乙型肝炎的治療中發揮重要作用;因此,在中藥新藥的篩選研究和開發中,大多圍繞這三方麵進行。
3.1 木脂素類
木脂素是一類由兩分子苯丙素衍生物(即C6-C3單體)聚合而成的天然化合物,多數呈遊離狀態,少數與糖結合成苷而存在於植物的木部和樹脂中。其分布較廣,目前已有200多種化合物,具有多種生物活性。
五味子化學成分比較複雜,含有五味子酚、五味子總多糖和18種以上氨基酸、16種以上微量元素及揮發油、木脂素等。張明華等[24]研究了五味子甲素和五味子醇甲對四氯化碳所致肝髒損傷的作用,結果表明該兩種木脂素增強了小鼠肝細胞抵抗CCl4毒性的能力,有保肝降酶作用。水飛薊素(silymarin)是天然的黃酮木脂素類化合物,難溶於水,口服吸收差。為了提高水飛薊素的生物利用度,肖東征等[25]利用磷脂酰膽堿與水飛薊素絡合生成水飛薊素磷脂複合物;並探討該複合物對小鼠急性肝損傷的保護作用。結果表明以水飛薊素磷脂複合物0.09,0.28,0.84g/kgbw對昆明種小鼠連續灌胃30天,以CCl4造成急性化學性肝損傷後,能降低血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬酸氨基轉移酶(AST)活性,減輕肝髒病理損傷(P<0.05)。提示水飛薊素磷脂複合物對CCl4造成的急性肝損傷有明顯的保護作用。
3.2 皂苷類
皂苷是存在於植物界的一類比較複雜的苷類化合物,其水溶液易引起肥皂樣泡沫,且多數具有溶血等特性;其結構有甾體皂苷、三萜皂苷兩種,在中草藥中廣泛存在。
絞股藍含有達瑪烷型絞股藍皂苷(gypenoside, GPS)。杜琰琰等[26]研究了絞股藍總皂苷、有機鍺對CCl4所致肝損害的拮抗作用,結果顯示GPS和有機鍺均可以明顯減輕CCl4所致脂肪樣變和肝壞死,GPS拮抗作用優於有機鍺。三七有效成分是三七總皂苷。陳廷玉等[27]報道:三七對CCl4致小鼠肝損傷具有保護作用,可顯著降低血清中ALT 和AST,增加血清中白蛋白(alb),並能明顯改善肝髒組織病理變化和超微結構變化。
3.3 多糖類
多糖通常是由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等聚合而成的高分子物質。中藥中常見的多糖為菊糖、澱粉、樹膠和粘液質等;近年來,多糖已引起國內外醫學界的重視,發現其具有很多治療作用。
從胡蘆巴中能提取出胡蘆巴多糖。黃玉萍等[28]采用四氯化碳(CCl4)、硫代乙酰胺(TAA)、撲熱息痛(AAP)致小鼠急性肝損傷模型,測定小鼠SGPT活性。結果表明:胡蘆巴多糖溶液對CCl4,AAP所致小鼠實驗性肝損傷有明顯保護作用,但其對TAA所致小鼠實驗性肝損傷無明顯的保護作用。提示胡蘆巴多糖可明顯降低CCl4,AAP致小鼠急性肝損傷模型SGPT活性,而對TAA致小鼠急性肝損傷模型SGPT活性無明顯作用。鞠洋等[29]報道從甘肅紅毛五加根與莖中提取的多糖成分對CCl4和D-氨基半乳糖、硫代乙酰胺等引起的小鼠、大鼠急性肝損傷有明顯保護作用;並提出其機製可能與降低過高的NO含量有關。昌友權等[11]也報道玉米須多糖對CCl4致肝損傷小鼠有保護作用,預先灌玉米須多糖(SMPS)溶液,具有顯著地抑製CCl4引起的小鼠SGPT,SGOT,LDH及肝髒MDA含量、肝髒指數的升高以及肝髒GSH含量的降低,並能顯著地減輕CCl4引起的肝小葉內的灶性壞死。金針菇有效成分主要是多糖。吳希哲等[30]研究金針菇提取物(FVE)對小鼠急性肝損傷轉氨酶活性的影響及其抗腫瘤能力,采用CCl4C和D-氨基半乳糖分別建立小鼠急性肝損傷模型,以FVE和陽性對照藥雲芝多糖灌胃治療,結果FVE 0.8 g/kg對CCl4和D-氨基半乳糖造成的小鼠急性肝損傷SGPT和SGOT活性升高有顯著的降低作用,與模型對照組相比,P<0.01。提示FVE 對肝髒損傷有保護作用,並對Heps腫瘤有抑製作用。
 
二、天然藥物有效成分提取分離技術的進展
天然藥物的化學成分十分複雜,提取其有效成分是天然藥物研究領域的一項重要內容。中藥是天然藥物的重要組成部分,下麵以中藥為代表介紹天然藥物有效成分提取分離技術的研究進展。
我們知道,中藥的有效成分一般是指具有明確的化學結構式和物性常數的化學物質,如果有效成分的濃度不高,就會加大服用劑量,同時由於無效或效用低的部分的存在會使中藥容易吸潮變質,難以保存, 因此有必要對中藥的有成分進行提取分離。
1 中藥傳統提取分離方法
在中藥製劑生產中,傳統的提取分離方法主要是采用有機溶劑萃取,主要有浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流法、酸堿法、沉降、過濾、離心、鹽析法、離子交換法和結晶法等。
由於中藥配方各異, 所含成分十分複雜,常用的提取方法在提取有效成分方麵,存在影響藥效、步驟複雜、能耗高、純度低、技術要求苛刻、有機溶劑消耗量大等問題[31] ,難以滿足市場供求雙方的要求,將來退出技術競爭也是必然。下麵簡要介紹部分中藥傳統提取分離方法:
浸漬法[32] 適用於有效成分遇熱易揮發和易破壞的中草藥的提取。按溶劑的溫度分為熱浸、溫浸和冷浸等數種。浸漬法的操作是先將中草藥粉或碎片裝入適當的容器中,然後加入適宜的溶劑( 如乙醇、烯醇或水等),浸漬藥材以溶出其中有效成分的方法。本法比較簡單易行,但提出率較低,並且如果提取溶劑為水的話,其提取液易於發黴變質,須注意加入適當的防腐劑。此外,最好采用二次或三次浸漬,以減少由於藥渣吸附導致的損失,提高提取率。
滲漉法[33] 具體操作是將中草藥粉末先裝在滲漉器中使藥材浸漬24~48 h 膨脹,然後不斷添加新溶劑,使其自上而下滲透過藥材, 從滲漉器下部流出、收集浸出液的一種浸出方法。當溶劑滲透進藥材細胞內溶出成分後,由於其比重加大而向下移動時,上層新加入的溶液使置換其位置,造成良好的濃度差,使擴散能較好地進行,提取的過程是一種動態過程,故浸出的效果優於浸漬法。但流速應該加以控製( 宜呈滴不宜成線) ,在滲漉過程中應該隨時從藥麵上補充加入新的溶劑,使藥材中有效成分充分浸出為止。當滲漉流出液的顏色極淺或滲漉液的體積相當於原藥材重的10 倍時,便可認為基本上已提取完全。滲漉裝置如圖1 所示。
煎煮法是我國最早使用的傳統的浸出方法。此法簡便易行,能煎出大部分有效成分,但煎出液中雜誌較多,且容易發生黴變,一些不耐熱揮發性成分易損失。一般藥材宜煎2 次。所用容器一般為陶瓷、砂罐或銅製、搪瓷器皿,不宜用鐵鍋,以免藥液變色。加熱時最好時常攪拌,以免局部藥材受熱太高,容易焦糊。
        回流提取法,應用有機溶劑加熱提取時,必須采用回流加熱裝置,以免溶劑揮發損失並減少有毒溶劑對實驗操作者的毒害。小量操作時,可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器,加熱前先開冷凝水。裝藥材量約為圓底燒瓶容量的1/3~1/2 為宜,溶劑浸過藥材表麵約1~2 cm,實驗室多采用水浴加熱,比較安全。第一次提取以保持沸騰回流約1 h 為宜,放冷後過濾, 再在藥渣中添加新的溶劑,做第二次、第三次加熱回流提取,分別約半小時,或通過薄層檢測有效成分基本提盡為止。此法提取效率較冷浸法高,但由於操作的局限性,大量生產中也少被應用,而是多采用連續提取法。
連續提取法[34] 是實驗室做中藥有效成分分析時,用有機溶劑提取中常用的方法,通常用脂肪提取器或稱索氏提取器( 如圖2 所示) 來完成。這種提取法,需用溶劑量較少,提取成分也少,但一般需數小時( 常6~8 h) 才能完成,所以遇熱不穩定易變化的中藥成分不宜采用此法。盡管如此, 在揮發性有機溶劑提取中草藥有效成分時,不論小型實驗或大型生產,均以連續提取法為好。
2 中藥現代提取分離方法
近年來,在中藥提取分離方麵出現了許多新工藝,這些新工藝的應用,使得中草藥提取既符合傳統的中醫理論,又能達到降低成本,提高有效成分的收率和純度的目的[35],推動了中藥的現代化進程,為我國的中藥走向國際市場奠定了基礎。現將提取分離新技術介紹如下。
2.1 超臨界流體萃取
超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction,簡稱SCFE)是一種以超臨界流體(SCF)代替常規有機溶劑對目標組分進行萃取和分離的新型技術[37],其原理是利用流體(溶劑)在臨界點附近某區域(超臨界區)內與待分離混合物中的溶質具有異常相平衡行為和傳遞性能、且對溶質的溶解能力隨壓力和溫度的改變而在相當寬的範圍內變動[38]來實現分離的。利用SCF作溶劑,可以從多種液態或固態混合物中萃取出待分離組分。由於CO2具有無毒、不易燃易爆、價廉、臨界壓力和溫度較低、易於安全地從混合物中分離出來等優點,所以,CO2是中藥有效成分提取與分離過程中最常用的一種SCF[39]。與傳統的提取分離法相比,SCFE最大的優點是可在近常溫條件下提取分離不同極性、不同沸點的化合物,幾乎保留產品中全部有效成分,無有機溶劑殘留,因此,其產品純度高,而且收率高、操作簡單、節能。通過改變萃取壓力、溫度或添加適當的夾帶劑,還可改變萃取劑的溶解性和選擇性[38, 40]。利用SCFE提取和分離中草藥有效成分,已引起國內外學者的廣泛關注[41, 42],並進行了許多相關研究,提出了多種中草藥的SCFE工藝條件[36],正逐步推廣應用到生產實際中。葛發歡等研究了超臨界流體萃取法從黃花蒿中提取青蒿素(Artemisinin)的新工藝[41]。青蒿素是來自黃花蒿(Artemisia annua)的一種倍半萜內酯類成分,是我國唯一得到國際承認的抗瘧新藥,傳統的汽油提取法存在著收率低、成本高和易燃易爆等缺陷,而采用SCFE工藝,從小試到中試放大,一直到200L設備的工業化生產證明,SFE-CO2工藝可用於青蒿素的生產,青蒿素產品符合中國藥品標準。該工藝比傳統法優越,產品收率提高1.9倍,生產周期縮短約100h,每千克成本降低四百多元,可節省大量的有機溶劑汽油,避免易燃易爆的危險,減少三廢汙染,大大簡化生產工藝。
2.2 超聲波提取技術
超聲提取技術(UE) 是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出,另外超聲波的次級效應,如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放並充分與溶劑混合利於提取。該技術具有提取時間短、產率高、無需加熱、低溫提取有利於有效成分的保護等優點。Li等[43]在從杜仲中提取綠原酸的研究表明超聲處理效率高於傳統提取方法。金瑩等[44]在蘋果多酚超聲波提取條件研究中,研究了蘋果多酚的超聲波法,並與與普通的溶劑提取法進行了比較,發現超聲波法提取效率較高, 可達94.2%。
2.3 微波萃取
微波萃取(MA) 是Ganzler於1986年首先提出的。微波萃取是指使用適合的溶劑在微波反應器中,從天然藥用植物、礦物、動物組織中提取各種化學成分的技術和方法。由於微波較強的穿透力,可使反應物內、外部分同時均勻、快速地加熱,可縮短生產時間,降低能耗,減少溶劑用量以及廢物的產生,同時可提高收率和提取物的純度[45] 。有報道[46]用微波輔助水提取法提取幹羅漢果中的羅漢果皂苷,結果顯示此法提取率為7015% ,比常規水提取法高45% ,還縮短了50%的時間。
2.4 高速逆流色譜分離技術
高速逆流色譜技術(High-speed Countercurrent Chromatography,簡稱HSC-CC)是一種不用任何固態載體或支撐體的液液分配色譜技術,是美國國家醫院Yiochiro Ito博士於上世紀60年代末首創的新型分離技術。HSCCC技術分離效率高、產品純度高、不存在載體對樣品的吸附和粘染,具有製備量大和溶劑消耗少等優點。至上世紀70年代末期,美國食品及藥物管理局(FDA)和世界衛生組織(WHO)開始利用此項技術分離抗生素,並進行成分鑒定[47]。上世紀80年代後期,各國學者迅速認識到該項技術的應用和開發價值,並廣泛用於天然藥物有效成分的分離製備和分析中。目前,已成功地開發出分析型、生產型兩大類高速逆流色譜儀,可分別用於中藥有效成分的分離製備和定量分析。進樣量可從毫克級到克級,進樣體積可從幾毫升到幾百毫升,不僅適用於非極性化合物的分離,也適用於極性化合物的分離;既可用於中藥粗提取物中各組分的分離,也可用於進一步精製[48]。1994年,HSCCC技術創始人Ito博士又發明了pH-局部精煉逆流色譜,使HSCCC的進樣量大大增加,能方便快速地分離克數量級樣品,更有利於中藥有效成分的分離製備。該技術有望成為中藥有效成分質量標準研究、分析的一種新方法,也會成為中藥製劑生產的一種新型分離技術。此外,高速逆流色譜技術還可與其他新型分離技術相耦合分離中藥有效成分。比如,巢誌茂[49],等人將高速逆流色譜與雙水相萃取技術相結合,以雙水相係統作為高速逆流色譜的固定相和流動相,對牛膝多糖成分進行了分離純化,成功地分離出多糖部分和蛋白多糖部分。
2.5 酶法
酶工程技術是近幾年來用於中藥工業的一項生物技術。中草藥成分複雜,有有效成分,也有如蛋白質、果膠、澱粉、植物纖維等非有效成分。這些非有效成分一方麵影響植物細胞中活性成分的浸出,另一方麵也影響中藥液體製劑的澄清度。傳統的提取方法(如煎煮、有機溶劑浸出和醉處理方法)提取溫度高, 提取率低,成本高,不安全,而用適當的酶,可通過酶反應較溫和地將植物組織分解,加速有效成分的釋放提取。選用適當的酶可將影響液體製劑的雜質如澱粉、蛋白質、果膠等分解除去,也可促進某些極性低的脂溶性成分轉移到水溶性溶劑中而有利於提取。這是一項很有前途的新技術,完全適於工業化大生產[50]
2.6 大孔吸附樹脂技術
大孔吸附樹脂[51-53]是20 世紀60 年代開發出的一類新型高分子分離材料。其分離純化的原理是利用特殊的吸附劑—大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結合的原理,從中藥煎液中有選擇性地吸附住其中的有效成分,去除雜質。特別是非極性吸附樹脂在吸附藥液中的有效成分時,主要是物理結構( 如比表麵積、孔徑等) 在起吸附作用。具體的操作方法就是將中藥、煎煮液通過大孔樹脂,吸附住其中的有效成分,然後經過洗脫,回收溶劑,除掉雜質,得目標成分。
其操作的基本程序大多是:中藥提取液→通過大孔樹脂吸附有效成分→乙醇溶液梯度洗脫→回收溶劑→得到藥液浸膏→幹燥→半成品。
該技術目前已比較廣泛地應用於中藥新藥的開發和中成藥的生產中,主要用於分離和純化苷類、生物堿、黃酮類成分及大規模生產。
2.7 雙水相萃取技術
雙水相萃取技術(ATPE) 是利用被提取物質在不同的兩相係統間分配行為的差異進行分離。與傳統的水煎醇沉相比,ATPE所形成的兩相大部分為水,兩相界麵張力很小,為有效成分的溶解和萃取提供了適宜的環境,相間質量傳遞快, 操作方便,時間短,條件溫和,易於工程放大和連續操作[54] 。盧俊彩等[55]利用ATPE技術從菠菜中提取蛻皮激素和20-羥基蛻皮激素,方法簡便、快捷、經濟。雙水相萃取技術具有較高的選擇性和專一性,為中草藥有效成分的提取提供了新的方法。
2.7 半仿生提取法
半仿生提取法(SBE) 是從生物藥劑學的角度,模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運情況,來設計提取工藝的方法。趙瑞芝等[56]采用半仿生法篩選益母草提取工藝,為其生產工藝提供了理論根據。該提取法可以提取和保留更多的有效成分,能縮短生產周期,降低成本,但是關於此技術的報道還較少。
2.9 分子印跡技術
分子印跡技術是近年來興起的一種極為方便而有效的製備對不同物質分子具有預定選擇性的聚合物的一種技術。近年,Hu等[57] ,以秦皮乙素為模板製備的分子印跡聚合物作為固相萃取材料,從中藥灰樹皮中提取出秦皮乙素。有關分子印跡技術在藥學領域的文獻半數以上涉及手性藥物的分離和分析,而其在中藥活性成分的分離純化中的應用雖然還不是很多,但都收到了較好的效果[58] 。
2.10 分子蒸餾法
分子蒸餾又稱短程蒸餾,是一種較新的液-液分離技術,尤其適用高沸點、熱敏性及氧化物係的分離。其具有蒸餾溫度低於物料的沸點、蒸餾壓強低、受熱時間短、分離程度口等特點,可大大降低口沸點物料的分離成本,極好的保護熱敏感物料。利用分子蒸餾對幹紅葡萄酒進行脫醇[59],使成品酒的乙醇含量由11. 5%降至0. 5%以下,同時最大程度地保持了原酒的風味、口感和色澤。
2.11 膜提取分離技術
膜提取分離技術是以壓力為推動力實現溶質與溶劑的分離,在常溫下操作,無相變、能耗低。使用膜技術(包括微濾、超濾、納濾和反滲透等) 可以在原生物體係環境下實現物質分離,可以高效濃縮富積產物,有效去除雜質。
其中,超濾膜分離技術是上世紀60年代發展起來的一種以多孔性半透膜作為分離介質的膜分離技術,具有分離不同分子量分子的功能。其特點是,有效膜麵積大、濾速快、不易形成表麵濃差極化現象、無相態變化、低溫操作破壞有效成分的可能性小、能耗低等。近幾年,國內外學者將超濾膜分離技術應用於中藥提取液的分離純化,效果良好,可與其他分離方法(如高速離心法、醇處理法等)結合用於中藥液體製劑的分離、提取和濃縮[60],而且還可用於除菌、除熱原。例如,應用超濾膜技術製備腦神寧膠囊,與傳統的醇沉法相比,具有中藥用量小、有效成分損失小、工藝流程縮短等優點[61]。目前該技術用於中藥生產剛剛起步,試驗研究較多。若用於大規模生產,在設備使用效率、工藝技術條件等方麵,還有待於進一步完善和提高。
2.12 色譜分離
色譜法是分離純化和定性定量鑒定中藥成分的重要方法之一。色譜技術的應用與發展,對於中草藥各類成分的分離鑒定起到了巨大的推動作用。色譜分離的基本原理是利用混合樣品的各組分在互不相溶的兩相溶劑之間的分配係數之差異( 分配色譜) 、組分對吸附劑吸附能力不同( 吸附色譜) 、分子的大小的差異( 排阻色譜) 或其他親和作用的差異,來反複地吸附或分配,從而使混合物中的各組分得以分離。目前,隨著色譜理論和電子學、光學、計算機等技術的應用[62-65],新的色譜技術不斷發展,色譜技術也日趨完善,這將對中藥活性成分的研究起到巨大的推動作用。
 
 
 
參考文獻
[1] 王明旭, 劉家全, 秦正. 醫藥知識產權戰略研究[M]. 北京: 軍事醫學科學出版社, 2004. 1.
[2] 宋曉亭. 保護中醫藥成為國際趨勢[J]. 中國醫藥報, 2007, (8): 30.
[3] 黃玉燁. 淺談中國中醫藥知識產權保護策略[J]. 科技與法律, 2005, (3).
[4] 張雪梅, 李祖倫. 試論民族醫藥的知識產權保護[J]. http: / / www. studa. net / yaoxue / 080522/ 17064336-2. html.
[5] 中醫藥知識產權保護的現狀, 問題與對策[J]. http: / / www. biox. cn / content / 20050417 / 11004. html.
[6] 白玉金, 劉潤蘭. 中醫藥知識產權保護的現狀及存在問題[J]. 山西中醫學院學報, 2003, 4(1): 47-49.
[7] 宋曉亭. 保護中醫藥成為國際趨勢[J]. 中國醫藥報, 2007, (8): 30.
[8] 陳鳳霞. 試析我國中醫藥知識產權保護問題與對策[J]. 雲南中醫學院學報, 2006, 29(2): 4-7.
[9] 現行知識產權製度在中醫藥領域中的運用[J]. http: / /www. plantextra. com / bbs / thread-3997-1-1. html.
[10] http: / /www. satcm. gov. cn / zwxx / flfg / xzfg /20060831 /100023. shtml.
[11] 張雪梅, 李 洪. 中藥知識產權保護的途徑[J]. 中國藥業, 2002, 11(10): 38.
[12] 花 拉. 試論蒙藥學的起源與發展[J]. 中國民族醫藥雜誌, 2000, (S1): 95-97.
[13] 方興東. 知識產權啟蒙: 誰才是真正的“盜版者”[EB/OL]. http: //www. bolaa. com / internet/ zhengcfalv/ index 20070513. Html, 2006-02-01.
[14] 程磊, 周秀佳. 植物生物堿抗腫瘤機理[J]. 中草藥. 2004, 35(2): 216.
[15] Dallavalle S, Ferrari A, Biadotti B, et al. Novel 7-oxyim inomethyl derivatives of cam ptothecin with potent invitro and invivo anti-tum or activity[J]. JM ed Ch em, 2001, 44: 2364-3274.
[16] Jeandet P, Bessis R, Manme B F, et a1. Effect of ecological practices on the resveractrol isomer content of wine[J]. J AgricFood Chem, 1995, 43(2): 316.
[17] 陳誌強, 吳祖澤. 天然多羥基芪類化合物抗病毒及抗腫瘤活性的研究進展[J].中草藥, 2003, 34(6): 附11.
[18] 初明, 魏蘭蘭, 胡誌強. 白藜蘆醇的化學防癌作用及其分子機理的研究進展[J].中國新藥與臨床雜誌, 2005, 24(3): 235.
[19] 黃華藝, 查錫良. 黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展[J]. 中國新藥與臨床雜誌, 2002, 21(7): 428.
[20] Hayashi K, hayashi T. A nature sulfated polysaccharide, calcum spirulan, isolated from Spirulina Platensis, invivo and exvivo evalution of anti-herpes simplex virus and antihuman immunodeficiency virus activities[J]. Aids Res Hum Retroviruse, 1996, 12(15): 1463.
[21] 丁棟興. 抗艾滋病病毒植物源藥物研究概況[J]. 安徽衛生職業技術學院學報, 2003, 6(2): 51.
[22] Lee J B, Hayashi K, Hayashi T, et al. Antiviral activity of rhamnan sulfate from Monostroma latissimum[J]. Planta Med, 1999, 65(5): 439.
[23] Amornrit C, Toida T. A new sulfated betagalactan from clam with anti-HIV activity[J]. Carbohydrres, 1999, 321(1-2): 122.
[24] 張明華, 陳虹, 李靈芝. 五味子甲素和五味子醇甲對四氯化碳所致肝髒損傷的保護作用[J]. 武警醫學, 2002, 13(7): 395-396.
[25] 肖東征, 高芄, 馬寧. 水飛薊素磷脂複合物對化學性肝損傷的保護作用[J]. 中國自然醫學雜誌. 2005, 7(3): 205-207.
[26] 杜琰琰, 莫自耀. 絞股藍總皂苷, 有機鍺對四氯化碳所致肝損害拮抗作用研究[J]. 職業醫學雜誌, 1996, 23(3): 8-10.
[27] 陳廷玉, 盧春風, 王培軍, 等. 三七對四氯化碳肝損傷小鼠的保護作用及形態學研究[J]. 黑龍江醫藥科學, 2003, 26(5): 30-31.
[28] 黃玉萍, 張黎明, 江麗霞, 等. 胡蘆巴多糖對小鼠實驗性肝損傷的保護作用[J].贛南醫學院學報, 2005, 25(6): 757-758.
[29] 鞠洋, 駱勤, 黨月蘭. 紅毛五加多糖對四氯化碳肝損傷大鼠的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床, 2005, 21(3): 25-26.
[30] 吳希哲, 高向東. 金針菇提取物的保肝及抗腫瘤作用[J]. 中國生化藥物雜誌, 2002, 23(4): l76-178.
[31] 李煥. 中藥提取分離技術的進展[J]. 中國藥房, 2007, 18(18): 1429-1431.
[32] 伍治, 高山鬆, 北京偉. 浸漬技術在中獸藥生產開發中的應用[J]. 北方牧業, 2003, 37-38.
[33] 譚桂蓮, 秦邦才. 中藥苦參提取方法的比較和工藝條件優化[J]. 時珍國醫國藥, 2006, (01): 49-52.
[34] 盧豔花. 中藥有效成分提取分離技術[M]. 化學工業出版社, 2005: 71-75.
[35] 潘五九, 肖小河, 袁海龍, 等. 中藥生產關鍵共性新技術研究進展[J]. 中草藥, 2005, 35(4): 361-367.
[36] Ocelyn P. Microwave extraction of volatile oils and apparatus therefore. European Patent Application, EP485668.
[37] Hauthal. W. H. Advances with supercritical fluids. Chemo-sphere, 2001, 43(1): 123.
[38] Johnston. K. P. et al. Water in Carbon Dioxide Microemulsions: An Environment for Hydrophiles Including Proteins. Science, 1996, 271: 624.
[39] 夏開元. 二氧化碳超臨界流體萃取研究進展. 中成藥, 1997, 19(5): 43.
[40] 葛發歡. 超臨界CO2從柴胡中萃取揮發油及其皂甙的研究. 中國中藥雜誌, 2000, 25(3): 149.
[41] 葛發歡. 等. 黃花蒿中青蒿素的超臨界CO2流體提取工藝研究. 中國醫藥工業雜誌, 2000, 31(6): 251.
[42] Smith R. M. Supereritical fluids in separation science—the dream, the reality and the future. J. Chormatogr. A, 1999, 856(1):83.
[43] Li H, Chen B, Yao S Z. Application of ultrasonic technique for extracting chlorogenic acid from Eucommia ulmodies Oliv. ( Eulmodies)[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2005, 12(4): 295-300.
[44] 金瑩, 孫愛冬, 崔莉, 等. 蘋果多酚超聲波提取條件研究[J]. 食品工業科技, 2005, 26(12): 99-100.
[45] 王豔, 張鐵軍. 微波萃取技術在中藥有效成分提取中的應用[J]. 中草藥, 2005, 36(3): 470.
[46] 黎海彬, 李琳, 胡鬆青, 等. 微波輔助提取羅漢果皂苷的研究[J]. 食品科學, 2003, 24(2): 92-95.
[47] 袁黎明, 等. 高速逆流色譜在植物有效成分提取中的應用. 藥物分析雜誌, 1998, 8(1): 60.
[48] 季大洪, 等. 高新工程技術在中藥提取分離的應用. 時珍國醫國藥, 2000, 11(4): 3.
[49] 巢誌茂, 等. 水性二相係統與逆流色譜對牛膝多糖的純化研究. 中國藥學雜誌, 1999, 34(7): 444.
[50] 陳棟, 周永傳. 酶法在中藥提取中的應用和進展[J]. 中藥材, 2007, 32(2): 99- 103.
[51] 向大雄, 李煥德, 朱葉超, 等. 大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的研究[J]. 中國藥學雜誌, 2003, 38(1): 35-39.
[52] 楊樺, 等. 大孔吸附樹脂用於川草烏中總生物堿的分離提取[J].中成藥, 2000, 22(8): 53-55.
[53] 呂茂平, 喬慶彬, 等. 大孔樹脂對梔子苷分離效果的研究[J]. 中草藥, 2002, 33(9): 794-799.
[54] 陸強. 提取與分離天然產物中有效成分的新方法—雙水相萃取技術[J]. 中成藥, 2000, 22(9): 653.
[55] 盧俊彩, 崔岩岩, 陳火林, 等. 丙酮—硫酸銨雙水相體係分離純化紅花紅色素[J]. 化學研究與應用, 2007, 19(6): 679-682.
[56] 趙瑞芝, 袁小紅, 林愛華, 等. 均勻設計法篩選益母草提取工藝[J]. 中藥材, 2006, 29(11): 1244-1245.
[57] Hu S G, Li L, He X W. Solid - phase extraction of esculetin from the ash bark of Chinese traditional medicine by using molecularly imprinted polymers[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1062(1): 1237.
[58] 林哲, 羅豔. 分子印跡技術在中藥活性成分分離純化中的應用[J]. 中草藥, 2007, 38(3): 457-460.
[59] 張健. 分子蒸餾生產無醇幹紅葡萄酒的研究[J]. 食品科技, 2007, 2: 193-196.
[60] 楊張渭, 等. 人參精采用超濾工藝的中試研究. 中成藥, 1994, 16(1): 4.
[61] 陳友鴻, 等. 超濾法在腦神寧膠囊研製中的應用. 中藥材, 1997, 20(6): 311.
[62] Mundkinajeddu Deepak, et al. Quantitative determination of the major constituents of verbena officinalis using hhgh performance thin layer chromatography and high pressure liquid chromatography [J]. Phytochemical Analysis, 2000, 351-355.
[63] Deng C. H. , et al. Recent developments in sample preparation techniques for chromatography analysis of traditional Chinese medicines[J]. J. Chromatorgram A, 2007, 90-96.
[64] Wang, X. J. , et al. Quality evaluation of Yin Chen Hao Tang extract based on fingerprint chromatogram and simultaneous determination of five bioactive constituents[J]. J. Separation Science, 2008, 31(1): 9-15.
[65] Zhao L. , et al. Characterization of constituents in Stellera chamaejasme L. by rapid- resolution liquid chromatography- diode array detection and electrospray ion-ization time- of- flight mass spectrometry[J]. Biomedic Chromatography, 2008, 22(1): 64-72.
 
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